【目的】筛选对烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）具有生防潜力的拮抗细菌，为烟草靶斑病的生物防治提供菌种资源。【方法】以立枯丝核菌为目标病原菌，采用梯度稀释分离法从广西健康烤烟根际土壤中分离、纯化细菌；采用平板对峙法筛选拮抗效果较好的菌株，测定抑菌效果；扫描电镜下观察拮抗菌株处理立枯丝核菌菌丝的形态变化；通过菌落形态观察、生理生化特征测定及16S rDNA和gyrA构建系统发育树鉴定拮抗菌株；采用双平板对扣法初步探索拮抗菌株挥发性物质（volatile organic compounds，VOCs）抑菌作用；利用顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱—质谱（GC-MS）对拮抗菌株挥发性物质进行鉴定；通过盆栽试验测定拮抗菌株对烟草靶斑病的防治效果。【结果】筛选到一株具有生防作用的拮抗菌株GXLL3319，鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。该菌株及挥发性物质对立枯丝核菌抑制率分别为69.70%和59.22%。扫描电镜结果显示，经GXLL3319处理后的立枯丝核菌菌丝生长受到明显抑制，菌丝出现断裂、膨大和消解等现象。挥发性物质鉴定出31种抑菌活性物质，包括酮类、醇类、醛类、杂环类、硫化物、有机酸类、酯类、烷烃类及酚类。盆栽试验结果表明，GXLL3319菌液能有效抑制烟草靶斑病的发生，相对防效达66.07%，与15%井冈霉素A可湿粉剂的相对防效差异不显著。【结论】枯草芽胞杆菌GXLL3319能有效抑制立枯丝核菌菌丝生长，其产生的挥发性物质包含多种抑菌活性物质，GXLL3319对烟草靶斑病有较好的防治效果，具有开发成为烟草靶斑病生防菌的潜力。