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花?抗缪勒氏管激素基因克隆、抗体制备及其对外源雌激素的响应 |
作者:
张李敏1 郭 琦1 王向斌1 黄 茜1 李学军1 周传江1 赵道全2 张建新1 刘慧芬1* |
单位: (1河南师范大学水产学院/河南省水产动物养殖工程技术研究中心 河南新乡 453007; 2河南省黄河流域伊洛河水生生物野外科学观测研究站 河南郑州 450000) |
关键词: |
分类号: |
出版年,卷(期):页码:2022 ,53 ( 10 ): 页码:2778-2786 |
摘要: |
【目的】克隆花?抗缪勒氏管激素基因Amh,分析其序列特征及亚细胞定位,检测不同浓度雌二醇处理下的表达变化规律,为后续研究Amh基因的功能及其在卵巢发育中分子机制提供理论参考。【方法】基于花?转录组文库测序结果,克隆Amh基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。构建重组表达质粒pET32a-Amh,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过免疫荧光技术检测荧光信号确定蛋白的亚细胞定位情况。同时,利用实时荧光定量PCR检测Amh基因在雌二醇处理后的表达情况。【结果】克隆的花?Amh基因cDNA序列全长为1849 bp,开放阅读框(ORF)为1671 bp,编码556个氨基酸残基。系统进化分析结果显示,花?Amh基因与斑马鱼、鲤鱼等鲤科鱼类Amh基因聚为一支,表明其亲缘关系较近。将纯化的AMH重组蛋白免疫小鼠以制备AMH多克隆抗体,通过酶联免疫方法(ELISA)检测其抗体效价为2.4×106以上,Western blotting检测显示抗体具有特异性。AMH蛋白在花?卵巢颗粒细胞表达。利用不同浓度的雌二醇处理花?60 d后发现,低浓度雌二醇(100 μg/g)促进花?卵母细胞生长,卵巢内皮质液泡数量增多。经雌二醇处理后,卵巢中Amh基因的表达量降低,说明雌激素在卵巢发育中对Amh基因表达具有抑制作用。【结论】Amh基因含有TGF-β家族典型的结构域,在卵巢颗粒细胞表达,且响应雌激素的调控,可能在花?卵巢发育中发挥调控作用。 |
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