【目的】比较分析20种溪蟹的线粒体COI基因序列，并基于COI基因序列构建溪蟹科系统发育进化树分析不同种类间的亲缘关系，探究COI基因作为分子标记在溪蟹物种鉴定中的适用性，同时为溪蟹科的物种鉴定及系统发育研究提供理论依据。【方法】测定2种龙溪蟹属（Longpotamon）代表种的线粒体COI基因全序列，结合GenBank中已公布的18种溪蟹科COI基因全序列，利用MEGA X计算其碱基组成、保守位点和遗传距离，采用MatGAT 2.02进行多序列相似性比较分析，并以PhyloSuite构建贝叶斯树（BI）和最大似然树（ML），探究溪蟹科物种内部的亲缘关系。【结果】20种溪蟹的COI基因序列全长1534~1539 bp，连续编码511~512个氨基酸残基，所有物种均以ATG为起始密码子；碱基含量略有不同，分别为35.9%~40.7%（T）、16.4%~20.2%（C）、26.8%~28.9%（A）和14.7%~17.2%（G），呈明显的AT偏向性。COI基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列比较分析结果显示分别有577和98个变异位点，表明密码子存在简并性。20种溪蟹的线粒体COI基因遗传距离、序列相似性及系统发育进化分析结果均显示，长安龙溪蟹（Longpotamon changanense）与龙溪蟹未定种（Longpotamon sp.）的亲缘关系最近。虽然采用不同方法基于不同数据集构建的系统发育进化树在拓扑结构上有所不同，但所有树型均显示龙溪蟹属（Longpotamon）的小龙溪蟹（L. parvum）并未与该属其他物种聚类在一起，华溪蟹属（Sinolapotamon）、近溪蟹属（Potamiscus）和小石蟹属（Tenuilapotamon）物种也散布在系统发育进化树不同分支中，暗示这些物种在分类鉴定上为非单系群，还需进一步研究确定。【结论】20种溪蟹的线粒体COI基因序列平均种间遗传距离为0.173，均具有区别于其他种类的特异位点，即线粒体COI基因序列可作为溪蟹科物种鉴定的分子标记。