【目的】利用eDNA宏条形码技术探究喀斯特高原人工湖泊鱼类多样性，并综合评估环境因子对鱼类分布的影响，为喀斯特地区水域鱼类多样性评估提供新方法、新思路，也为红枫湖和阿哈湖鱼类保护管理措施的制定积累基础资料。【方法】以红枫湖和阿哈湖为代表采集水样，以Tele 02硬骨鱼类通用引物PCR扩增eDNA，在Illumina NovaSeq 6000测序平台完成高通量测序；对优质序列按照98%相似性进行OTU聚类，生成OTUs表格，通过基因注释获得鱼类物种信息，并以R语言分别进行PerMANOVA分析和冗余分析（RDA）。【结果】在红枫湖鉴定出鱼类32种，隶属于5目11科27属，其中鲤形目鱼类18种，红枫湖南、北湖鱼类群落结构差异不显著（R2=0.08，P=0.562>0.05）；在阿哈湖鉴定到鱼类33种，隶属于6目12科28属，其中鲤形目鱼类18种，各采样点检出鱼类总数差异不明显，保持在28~32种。现阶段的红枫湖和阿哈湖鱼类组成以鲤形目鱼类为主，但存在以日鲈目为主的养殖鱼类生态入侵。红枫湖环境因子与鱼类群落结构差异的决定系数（R2）排序为溶解氧（DO）>总溶解固体（TDS）=水温（WT）>pH>离子氨（NH4+），DO（P=0.034）是引起红枫湖各采样点鱼类群落结构差异的主要环境因子；阿哈湖环境因子与鱼类群落结构差异的决定系数（R2）排序为TDS>WT>Tra>NH4+>DO，TDS（P=0.005）是引起阿哈湖各采样点鱼类群落结构差异的主要环境因子。【结论】现阶段的红枫湖和阿哈湖鱼类组成以鲤形目鱼类为主，但存在以日鲈目为主的养殖鱼类生态入侵。eDNA宏条形码技术在喀斯特高原水域鱼类多样性评估方面具有较好的适应性，可快速监测到鱼类群落结构和空间分布，但通用引物可能对某些鱼类存在扩增偏好性；此外，不同人工湖泊水质理化因子特异性较强，研究环境因子与湖泊鱼类群落的关系时应对每个湖泊单独进行评估。