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鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒三重PCR检测方法的建立及应用
作者: 奉 彬  谢芝勋*  邓显文  张艳芳  谢丽基  谢志勤  范 晴  

曾婷婷  罗思思  黄娇玲


  
单位: (广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室  南宁 530001)  
关键词:
分类号:
出版年,卷(期):页码:2019 ,50 ( 11 ): 页码:2576-2582
摘要:

【目的】建立能同时检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)和禽流感病毒(AIV)的三重PCR检测方法,为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因(登录号DQ195265.1)、ChPV的NS1基因(登录号GU214704.1)和AIV的M基因保守区(登录号DQ485211.1),设计合成针对NDV、ChPV和AIV的特异性引物,应用这3对引物建立三重PCR检测方法,对反应体系及扩增程序进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测等评估其实用性。【结果】优化后的三重PCR反应体系为ChPV和AIV的上、下游引物各0.5 μL,NDV的上、下游引物各1.0 μL,NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0 μL,Premix TaqTM 12.5 μL,无RNase水补足至25.0 μL。最佳扩增程序:95.0 ℃预变性5 min;94.0 ℃ 1 min,58.5 ℃ 1 min,72.0 ℃ 1 min,进行35个循环;72.0 ℃延伸10 min,12.0 ℃结束反应。建立的三重PCR能同时扩增出NDV(453 bp)、ChPV(687 bp)和AIV(239 bp)的特异性条带,对应的最低检测下限分别为2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV,但扩增传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)和禽肺炎病毒(APV)等病原体均呈阴性。应用建立的三重PCR对50份鸡喉头或泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品,其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品,1份ChPV和NDV均呈阳性的样品,与常规PCR的检测结果一致。【结论】建立的三重PCR能同时对NDV、ChPV和AIV 3种病原进行特异性诊断,在混合感染病例鉴别诊断方面具有广阔的应用前景。

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