【目的】分析无刺龙舌兰叶绿体基因组特征及密码子偏好性，为无刺龙舌兰叶绿体相关基因的表达、修饰和物种进化研究提供参考。【方法】对无刺龙舌兰的叶绿体基因组进行测序、组装和注释，分析密码子偏好性及其影响因素，并通过建立高、低基因表达库，筛选出最优密码子。基于20个已发表的龙舌兰科植物叶绿体基因组数据构建系统发育进化树。【结果】无刺龙舌兰叶绿体基因组总长157579 bp，大单拷贝区（LSC）、小单拷贝区（SSC）和2个反向重复区（IRa和IRb）的长度分别为85940、18279和26680 bp，GC含量为37.8%，包括135个基因（85个蛋白编码基因、38个tRNA基因、8个rRNA基因及4个未知功能的基因），从中筛选出51个长度大于300 bp的基因编码区（CDS）序列，其有效密码子数（ENC）均大于41.0。GC1、GC2、GC3和GC3s含量分别为46.75%、39.61%、29.19%和26.06%，说明密码子第3位多以A/T结尾。GCall与GC1、GC2和GC3均呈极显著相关（P<0.01，下同），但GC3与GC1和GC2均无显著相关性（P>0.05，下同），表明密码子第1、2位的碱基组成相似，但与第3位的相似度不高。选择和突变是导致叶绿体基因组密码子偏好性的主要因素。筛选出14个多以A/U结尾的最优密码子。无刺龙舌兰与克雷塔罗丝兰和西地格丝兰为姊妹关系，自荐值为100%。【结论】无刺龙舌兰叶绿体基因组为保守的四分体结构，叶绿体基因组密码子偏好性较弱，主要受选择和突变等多因素影响。基于植物叶绿体基因组构建系统发育进化树在物种的分类鉴定及确定各物种间系统发育关系的研究中是一种准确、可靠的方法。