【目的】从蛋白水平阐明牦牛抗寒性能机理，并进一步从营养学角度提高其代谢性能，为牦牛有效抵御外界恶劣气候条件提供科学依据。【方法】应用TMT蛋白组学技术对寒冷季节（1月）和温暖季节（8月）的牦牛抗冻蛋白进行挖掘，并对鉴定到的牦牛抗冻蛋白进行亚细胞定位、结构域、GO功能富集、KEGG信号通路注释、蛋白相互作用等生物信息学分析。【结果】从牦牛耳组织中共鉴定获得21856个肽段（Peptide），其中特有肽段（Unique peptide）序列为18452个，定量获得4519个蛋白，最终筛选出144个差异蛋白，其中上调蛋白89个、下调蛋白55个。144个牦牛抗冻差异蛋白亚细胞定位到7个条目上，分别是细胞核蛋白56个、细胞质蛋白51个、质膜蛋白24个、细胞外蛋白23个、线粒体蛋白18个、细胞骨架蛋白1个和溶酶体蛋白1个；共鉴定到194个结构域。GO功能富集分析结果显示，生物过程主要富集到细胞过程蛋白79个、代谢过程蛋白70个和生物调控蛋白42个等，分子功能主要富集到结合功能蛋白75个和催化活性蛋白64个等，细胞组分主要富集到细胞部分蛋白89个和细胞蛋白89个等。144个牦牛抗冻差异蛋白在KEGG数据库中注释到205条KEGG信号通路，主要涉及核糖体、氮代谢、胞质DNA感受、动物体内生热作用、氧化磷酸化、白细胞介素-17及钙离子信号等通路。牦牛抗冻差异蛋白相互作用网络分析发现L8IHE5的关联度最高，且冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）和HSP70结合蛋白在蛋白相互作用网络中具有更多的相互作用关系。【结论】基于TMT蛋白组学对牦牛抗冻差异蛋白进行挖掘，结果鉴定获得144个抗冻差异蛋白（上调蛋白89个，下调蛋白55个），其中CIRP和HSP70在冷应激条件下呈上调趋势，能促使牦牛肌体适应低温环境，可作为牦牛抗冻性育种的候选分子标记。