【目的】利用核糖体DNA（nrDNA）ITS序列和叶绿体DNA（cpDNA）psbA-trnH序列对云南不同地理区域的黄毛草莓进行分子鉴定，并分析不同地理居群间的分子进化及地理分布特征，为黄毛草莓种质鉴定、保护及开发利用提供理论依据。【方法】以云南省12个不同地理区域的黄毛草莓居群样品为材料，PCR扩增其ITS和psbA-trnH序列，并进行双向测序及序列合并，分别基于ITS和psbA-trnH序列及二者合并序列构建系统发育进化树。最后利用DnaSP 5.10对ITS和psbA-trnH序列进行核苷酸多样性（π）及单倍型数目、类型和多样性（Hd）分析，并对黄毛草莓居群进行中性检验及分子进化特征分析。【结果】基于ITS和psbA-trnH序列的聚类分析结果均显示，12个不同地理区域的黄毛草莓居群样品均与GenBank数据库中下载的黄毛草莓聚在一个分支上，分支自展值均大于阈值（75%），表明这两种序列均可用于黄毛草莓种质的分子鉴定。基于二者合并序列的聚类分析结果与上述结果基本一致，但分支自展值达99%，表明该聚类分析结果更可靠。不同地理区域的黄毛草莓ITS序列间的遗传距离为0~0.014，排序为迪庆州>昆明市>文山州，psbA-trnH序列间的遗传距离为0~0.025，排序为昆明市>迪庆州>文山州，推测ITS和psbA-trnH序列均能显示黄毛草莓居群遗传分化与地理分布格局的相关性。ITS序列长度为668 bp，变异位点百分率为1.8%，共有8种单倍型，Hd和π分别为0.894±0.078和0.006，以昆明市黄毛草莓样品的单倍型最多，为4种；psbA-trnH序列有203 bp，变异位点百分率为2.5%，psbA-trnH序列共有5种单倍型，Hd和π分别为0.788±0.090和0.009，以昆明市黄毛草莓样品单倍型最多，为3种，表明两种序列的单倍型均呈现地理分布格局。黄毛草莓ITS和psbA-trnH序列的中性检验Tajima’s D值分别为-0.673和0.227（P>0.1），表明云南省12个不同地理区域的黄毛草莓居群保持稳定状态，在截至目前的历史时间内不存在扩张。【结论】从云南不同地理区域采集的样品均为黄毛草莓。ITS序列和psbA-trnH序列均可作为黄毛草莓的DNA条形码，二者的合并序列更能准确鉴定黄毛草莓种，适用于黄毛草莓分子谱系地理学研究。