【目的】利用高效基因编辑系统（pHDE-Cas9）构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CTX）基因家族规律成

簇的间隔短回文重复（CRISPR）载体，为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础。【方法】设计巨桉CTX基因靶

位点和引物，扩增pCBC质粒上的目的片段，BsaⅠ酶切pHDE载体并与目的片段连接形成重组质粒，转化DH5α感受态

细胞。提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证，挑选阳性克隆质粒进行测序分析，构建CTX基因家族

CRISPR载体。【结果】重组质粒PCR鉴定及测序结果表明，重组载体序列无突变，与预期序列高度一致。成功构建了

巨桉CTX基因家族pHDE-CTXA、pHDE-CTXB和pHDE-CTXC同源表达载体。【结论】利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉

CTX基因家族CRISPR载体，构建过程快速、高效，为桉树基因组定点编辑打下了基础，也可为其他桉树CRISPR/Cas9表

达载体的构建提供借鉴。